血細胞計數原理

血細胞計數原理

細胞培養技術中，細胞計數是一項基本功，對于標準化培養條件以及需要定量的實驗來說都關鍵。這里介紹使用血細胞計數器對細胞進行計數的經典方法以及中間一些需要注意的細節。
制備細胞懸液：
對于貼壁生長的細胞，我們需要使用胰酶消化的方法使細胞從培養皿表面脫落
根據需要加入合適體積的培養基，將細胞進行中和及稀釋，以得到均質的細胞懸液。要求盡可能將細胞吹打散開，不要殘留任何細胞團
準備血細胞計數器：
使用70%乙醇將蓋玻片和血細胞計數器清潔干凈
將將蓋玻片潤濕（使用水或呼一口氣，目的是使蓋玻片與血細胞計數器接觸更緊密，易于粘連），并覆蓋至血細胞計數器上
臺盼蘭染色（可選）：
如果需要計算細胞的活力，則需要將細胞懸液和0.4%臺盼蘭等體積混合
室溫孵育3-5分鐘，使臺盼蘭進入死細胞，使死細胞著藍色
血細胞計數器加樣：
使用吸管將細胞懸液或細胞/臺盼蘭混合液滴加到血細胞計數器計數池的邊緣。此時液滴將在虹吸的作用下進入蓋玻片下方的計數池
以同樣的方式在另一側的計數池中也加入細胞懸液
將計數板放置幾分鐘使細胞擴散，同時用吸水紙吸除多余的液體
細胞計數：
在100倍顯微鏡下，移動計數板將視野對準計數板的中央大方塊，該方塊四周有一圈3條平行線包圍，中間有密集的網格。中央方塊區差不多剛好可以填滿整個視野
使用手持式計數器記錄計數池四個角以及中央方塊內的細胞數（1-5號位置，經典的current-protocol推薦每個方塊細胞數應不大于20-50），并重復記錄另一側計數池中的細胞數，總計十個方塊。計數的方法是只計算上邊和左邊壓線的細胞，而右邊和下邊壓線的細胞不予計算（下圖，總體原則是“計上不計下，計左不計右"，判斷標準為是否接觸三條邊線的中間線）。如果有多個細胞沒有吹散成團存在，此時只可記為一個細胞。如果團塊很多，則可能需要重新吹打甚至消化直至絕大多數細胞為單個細胞